l02细胞进行复苏的原则及步骤

　　l02细胞复苏的原则：快速融化：需要将冻存在-196℃液氮中的细胞快速融化至37℃，使细胞外冻存时的冰晶迅速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害。

　　（一）实验前准备：

　　1、将水浴锅预热至37℃

　　2、用75%酒精擦拭紫外线照射30min的超净工作台台面。

　　3.、在超净工作台中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶等等4、将RPMI1640培养液、胎牛血清、从4℃冰箱拿出5、配制适量含10%的胎牛血清及青莲霉素混合液（1×）的*培养液放入4℃冰箱内备用。

　　（二）细胞复苏：

　　1.取液氮中冻存细胞，于37C水浴锅中不断的摇动，使管中的液体在1min内迅速融化，取出用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，拿入超净台内，将冻存管内细胞吹打混匀后吸入10m1离心管内，缓慢加入5-8ml含胎牛血清和青链霉素的*培养液。

　　2.离心机内配平离心，1000r/min离心5min，吸弃上清液，将剩余细胞吹打混匀制成悬液转移入培养瓶内，加入*培养液6ml，将培养瓶放入37℃和5%C02的培养箱内孵育。

　　l02细胞消化及传代：

　　1.从培养箱内取出细胞：注意取出细胞时要旋紧瓶盖，用酒精棉球擦拭显微镜的台面，再在镜下观察细胞。打开瓶口：将各瓶口一一打开，同时要在酒精灯上烧口消毒。

　　2.小心吸出旧培养液，用PBS冲洗两遍后，加入适量消化液（EDTA胰蛋白酶液），注意消化液的量以盖住细胞。显微镜下观察细胞：若胞质回缩，细胞之间不再连接成片，表明此时细胞消化适度。

　　3.加入5ml培养液终止消化，用滴管将已经消化细胞吹打成细胞悬液吸细胞悬液入离心管：将细胞悬液吸入10ml离心管中。平衡离心：平衡后将离心管放入台式离心机中，以1000转/分钟离心5分钟。