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l02细胞进行复苏的原则及步骤

发布时间:2021-06-22浏览:124次

  l02细胞复苏的原则:快速融化:需要将冻存在-196℃液氮中的细胞快速融化至37℃,使细胞外冻存时的冰晶迅速融化,避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶,对细胞造成损害。
  (一)实验前准备:
  1、将水浴锅预热至37℃
  2、用75%酒精擦拭紫外线照射30min的超净工作台台面。
  3.、在超净工作台中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶等等4、将RPMI1640培养液、胎牛血清、从4℃冰箱拿出5、配制适量含10%的胎牛血清及青莲霉素混合液(1×)的完全培养液放入4℃冰箱内备用。
  (二)细胞复苏:
  1.取液氮中冻存细胞,于37C水浴锅中不断的摇动,使管中的液体在1min内迅速融化,取出用酒精棉球擦拭冻存管的外壁,拿入超净台内,将冻存管内细胞吹打混匀后吸入10m1离心管内,缓慢加入5-8ml含胎牛血清和青链霉素的完全培养液。
  2.离心机内配平离心,1000r/min离心5min,吸弃上清液,将剩余细胞吹打混匀制成悬液转移入培养瓶内,加入完全培养液6ml,将培养瓶放入37℃和5%C02的培养箱内孵育。
  l02细胞消化及传代:
  1.从培养箱内取出细胞:注意取出细胞时要旋紧瓶盖,用酒精棉球擦拭显微镜的台面,再在镜下观察细胞。打开瓶口:将各瓶口一一打开,同时要在酒精灯上烧口消毒。
  2.小心吸出旧培养液,用PBS冲洗两遍后,加入适量消化液(EDTA胰蛋白酶液),注意消化液的量以盖住细胞。显微镜下观察细胞:若胞质回缩,细胞之间不再连接成片,表明此时细胞消化适度。
  3.加入5ml培养液终止消化,用滴管将已经消化细胞吹打成细胞悬液吸细胞悬液入离心管:将细胞悬液吸入10ml离心管中。平衡离心:平衡后将离心管放入台式离心机中,以1000转/分钟离心5分钟。

 

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