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大鼠滑膜细胞的制备方法

发布时间:2022-06-24浏览:41次

  大鼠滑膜细胞的制备方法:
 
  滑膜细胞的培养:将分离的滑膜组织用含青霉素200kU/L、链霉素200mg/L的D-Hank's液漂洗3次以减少污染机会;去掉脂肪组织,将16个滑膜组织样本平均分为A、B两份。将A份不加处理分为A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7、A8八个样品,将B份用手术剪剪碎后分为B1、B2、B3、B4、B5、B6、B7、B8八个样品。分别采取4种不同方法进行处理。
 
  1)不加消化酶消化法:分别将A1、A2、B1、B2离心洗涤2次(2500r/min,离心6min),吸弃上清液,加入100μL100%的FBS混匀,用移液枪吸出注入培养瓶中,放入CO2培养箱烘干15min,再将A1、B1加入3mL体积分数20%的FBS吹打均匀,A2、B2用少量体积分数20%的FBS人工贴壁,再加入3mL体积分数20%的FBS。
 
  2)加Ⅱ型胶原酶消化法:将A3、A4、B3、B4离心洗涤2次(2500r/min,离心6min),吸弃上清液,吸取胶原酶Ⅱ至离心管中,轻轻吹打使组织块重新悬浮,移入培养瓶,放入CO2培养箱消化,观察组织成絮状后,加入1mL体积分数20%FBS终止消化,用移液枪吸出,移入离心管离心(2500r/min,离心6min),弃上清液,放入培养瓶中,A3、B3加入3mL体积分数20%FBS,吹打均匀;A4、B4用少量体积分数20%的FBS人工贴壁,再加入3mL体积分数20%的FBS。
 
  3)加胰蛋白酶消化法:将A5、A6、B5、B6离心洗涤2次(2500r/min,离心6min),吸弃上清液,吸取胰蛋白酶至离心管中,轻轻吹打使组织块重新悬浮,移入培养瓶,放入CO2培养箱消化,观察组织成絮状后,加入体积分数20%FBS终止消化,用移液枪吸出,移入离心管离心(2500r/min,离心6min)。弃上清液,放入培养瓶中,A5、B5加入3mL体积分数20%FBS,吹打均匀;A6、B6用少量体积分数20%的FBS人工贴壁,再加入3mL体积分数20%的FBS。
 
  4)先加Ⅱ型胶原酶消化法再加胰蛋白酶消化:将A7、A8、B7、B8离心洗涤2次(2500r/min,离心6min),吸弃上清液,吸取胶原酶Ⅱ至离心管中,轻轻吹打使组织块重新悬浮,移入培养瓶,放入CO2培养箱消化,观察组织成絮状后,取出培养瓶,仔细吹打使组织块分散,将未黏附细胞移入离心管离心(2500r/min,离心6min),弃上清液,再加D-Hank's液洗涤,离心,吸弃洗涤液,重复离心3次,吸取胰蛋白酶至离心管中,轻轻吹打使组织块重新悬浮,移入培养瓶,放入CO2培养箱消化,消化结束取出培养瓶,加入体积分数20%FBS终止消化,用移液枪吸出,移入离心管离心(2500r/min,离心6min)。弃上清液,放入培养瓶中,A7、B7加入3mL体积分数20%FBS,吹打均匀;A8、B8用少量体积分数20%的FBS人工贴壁,再加入3mL体积分数20%的FBS。
 
  5)结果:培养9d后,观察各培养瓶中细胞的成活个数和生长状况,组织剪碎不加消化酶人工贴壁培养的细胞得数为2.03×106,是所有培养方法中细胞的数最多的。细胞活力为95%,与组织剪碎加胶原酶Ⅱ消化后人工贴壁培养同为各种培养方法中细胞活力*强的,综合考虑最优方法为组织剪碎不加消化酶人工贴壁培养。

 

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