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细胞世界:细胞培养时候里面的圆球球到底是什么?

更新时间:2023-03-13浏览:672次

细胞培养千千万,隔天一看全完蛋。我待细胞如初恋,奈何细胞黑了脸。试问何处方有解,细胞世界看小尚。科研正道是沧桑,山高水远伴君旁。

Hello,各位小伙伴们大家好,我是尚恩生物技术支持小尚,欢迎大家来到尚恩生物科普类技术讲解栏目-细胞世界,本栏目致力于深入浅出的对细胞培养过程种所遇到的一些现象进行讲解,欢迎持续关注。好了,今天就先水到这,话不多说,咱们直接开始。

相信很多小伙伴们在进行贴壁细胞培养时经常会看到一些比较大的圆形透亮的东西,谨慎且好奇的小伙伴不禁心里泛起嘀咕:

这到底是什么?以前怎么没有见过?会不会是污染了奇奇怪怪的东西?


(什么?你说你没有见过?那有没有一种可能,你看细胞过于专注于贴壁的细胞了,根本没有注意到圆圆的?)

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小伙伴A:IEC-6细胞,细胞从一开始就有小圆圈圈,形态不一致,是不是真菌污染了



小伙伴B:A2780这种亮晶晶的细胞,是杂细胞吗 我之前买过类似的细胞,里面有杂细胞,我怕又买了杂细胞。


这时候就轮到有8年多细胞培养经验、6年技术支持经验的小尚出马了。

我们先指出来这两个客户反应的问题在哪,免得有些过于专注贴壁细胞的小伙伴还没看出来这两个小伙伴讲的是个啥。


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喏,看到红色箭头指的位置了嘛,就是这个圆圆的,为了方便,我们在这里就把它叫做球球

(这里不得不吐槽下,有些小伙伴的拍照技术真的堪忧,你笑别的小伙伴拍的看不清,殊不知更有小伙伴拍的连细胞都看不到。一想到这,小尚不禁泪流,看了六年的照片,六年!你知道这六年我怎么过的嘛?你们这拍照技术,给对象拍照那不得分分钟被爆锤?)

好了,回归正题。


真菌排除

首先,球球这个东西肯定不是小伙伴A说的真菌,因为大部分常见的真菌在培养基里都是以营养体的形式存在,其中大部分又是呈树枝状分叉或者规则形态的菌丝,就像下面这样。


这样看明显都不是圆形的,基本可以排除这部分真菌。当然还有一部分单细胞真菌是圆形的,比如酵母菌,它就长这样。

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那有反应快的小伙伴就激动了:对对对,就是它就是它,球球就是酵母菌,罪魁祸首!

▶小尚跟你说:小伙子反应快是好事,但你还是太年轻,把握不住,给你五毛,撤回让我来。其实实际上球球也并不是酵母菌,原因很简单,常见酵母菌大小比哺乳动物细胞还是小很多的,就像下图这样,其中培养的细胞大家都看得出来,而那真菌黑色箭头指的才是酵母菌,是不是比细胞小多了?这样看就对比很明显了,大小差异几乎直接可以排除酵母菌的可能。

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那又有较真的小伙伴说了:那真菌也有大的啊,不可能是一些大的真菌嘛。

▶小尚跟你说:这又涉及到另一方面了,真菌作为比较简单的生物,其增殖速度通常是比哺乳动物的细胞快很多的。如果真菌都到能在显微镜下轻易看到的程度,那这个细胞再在培养箱甚至室温放1-2天,就会明显浑浊到肉眼可见的程度,也基本上宣告细胞凉凉了,根本没有办法继续培养。

所以,通过形态、大小差异和生长速度判断,球球不是真菌。


杂细胞排除

接下来,我们看看是不是小伙伴B说的杂细胞呢?

这种情况通常就不是简单的看形态下可以分辨出来的了,必须要进行实验进行验证。

第一种实验很简单,我们姑且取名培养法,就是利用贴壁程度差异收集圆形和贴壁细胞分别培养,看最终培养出来的细胞是否一样。如果确实长出来的细胞是一样的,基本可以确认不是杂细胞;如果长出来确实不一样,就得利用到下面的方法了。

第二种方法是进行标志物检测,我们都知道不同类型的细胞标志物不一样,比如内皮细胞标志物是CD31、成纤维细胞标志物是Vimentin等,这类标志物可以一定程度上反应细胞是否存在杂细胞。当然实际上来说,原代细胞提取必然存在部分杂细胞,检测阳性率肯定不会是100%。细胞系和细胞株理论上来说是纯细胞,那应该阳性率是100%了?这还真不一定,例如CA46细胞(DSMZ ACC-73)标志物CD19表达率99%、CD20表达率92%,确实是会有一些细胞不表达标志物,但这也不能说明细胞不纯。细胞在不同增殖周期、不同培养条件下标志物表达情况都会有差异,这个是很正常的现象。就像即使是双胞胎,总会有这里那里的区别,正如世界上没有相同的两片树叶这句话一样。所以,标志物检测也只能作为参考,并不能断定。

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第三种方法就是进行细胞鉴定了,这就是最客观公正的验证方式了,这里又可以分两个情况

第一个情况就是不同种属细胞交叉污染,另一种是同种属交叉污染。

⊙1.前者只要做个种属鉴定就可以了,种属特异性引物、试剂盒、检测服务在很多公司都有,相对来说比较简单。

⊙2.第二个情况是必须对细胞进行STR鉴定了,STR鉴定可以有效的分辨同种属之间的细胞交叉污染(不了解STR过程的小伙伴可以查下相关资料,需要讲解的话可以私信吱一声,如果需要了解的小伙伴多的话,我们可以在后续专门讲解)。STR是目前可靠的细胞鉴定方法,但这种方法也有局限性,那就是这个必须有相应的特异性引物才能对该种属进行鉴定,同时也必须要有公开的位点信息才能做细胞系匹配。目前人源STR比较成熟,相关位点和引物都满足科研甚至是诊断需要,基本可以判断细胞是否存在交叉污染甚至是确认污染的是那个细胞系(顺带提一句,小尚家的人源细胞提供STR报告,可以排除细胞存在交叉污染的情况哦);小鼠源的STR近些年也有发展,但总体来说目前只有80来种细胞系有位点可以匹配,其他没有公开的位点,由于位点缺乏可对比性,所以相对来说检测结果大部分不能用于细胞匹配,用来判断细胞是否存在交叉污染是没有问题的,但基本无法判断是什么细胞交叉污染;至于大鼠、猴、鸡、狗、猪等其他种属,那就更惨了,目前一个公开的位点都没有,做出来STR只能判断细胞是否交叉,根本没法判断交叉的种类。

其实呢,虽然国内细胞相关产业相比国外起步晚,但近几十年确实得到了飞速发展,细胞保种都相对比较规范了,极少出现细胞相互交叉污染的情况。小尚自己也做过很多细胞的鉴定,基本不存在细胞交叉污染的现象。有很多细胞其实本身就是有多种形态存在的,鉴定结果显示他们确实都是一样的细胞。当然,各位小伙伴在培养的时候还是得规范操作,避免细胞间交叉污染,因为一旦交叉污染就不能用了,只能重新培养。



看了这么久,相信很多小伙伴都挠头了,如果说球球不是真菌也不是杂细胞,那到底是什么?

我们先看一段视频,注意仔细盯着球球看,可以多看几遍盯着不同位置的球球看。


(来源日本JCRB细胞库资料)




发现了嘛,这个球球大部分都会一分为二并在之后化身贴壁细胞消失不见。

所以答案揭晓,球球其实也是正常的细胞,由于空间不足或者其他原因导致没有贴壁而呈圆形生长,同时又由于细胞是一直在增殖的,所以这个球球贴壁了,那个球球又冒出来了,看起来就像是一直都存在一样,其实人家已经一批又换一批了。


这个其实是细胞增殖过程中很常见的现象,相信之前就有不少小伙伴查过很多细胞库的很多细胞形态照片,或许只是未注意到这种情况。这个还是非常常见的现象,不代表细胞存在污染或者不纯哦。


好的,今天的细胞世界带大家了解了球球具体是什么,相信大家已经非常清楚的了解到了,之后实验也可以更加胸有成竹了。

小尚掐指一算,肯定有很多小伙伴也想看看自己养的细胞到底是怎么增殖的。上面细胞增殖视频用到的是细胞增殖延时摄影技术,其实原理就是在一段时间内通过显微镜以特定的速率(通常为帧/秒(fps))捕捉标本的图像,最终合成一段细胞增殖的视频。当然大部分小伙伴应该是用不上这个的,不过为了满足大家好奇心,小尚特意准备了日本JCRB细胞库视频查询,其中有600多种细胞增殖的延时摄影视频,有兴趣的小伙伴们可以去搜搜看有没有自己培养的细胞的增殖视频。

JCRB细胞库视频查询:

最后,祝各位小伙伴培养的细胞越来越好,实验顺顺利利,科研路途一路坦荡。


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