细胞攻略 | HepG2(人肝癌细胞)培养教程

细 胞 基 本 信 息

▲细胞正常生长形态照片

细胞名称:HepG2(人肝癌细胞)

细胞别称: HEP-G2; Hep G2; HEP G2; Hep-G2; HEPG2

细胞货号: SNL-083

生长特性: 贴壁

培养条件: EMEM(MEM+NEAA)+10% FBS+1% P/S

培养环境: 空气，95%；二氧化碳 (CO₂)，5%；37℃

细胞简介: HepG2细胞是从患有肝癌的15岁白人男性青年的肝细胞癌中分离出来，细胞表达甲胎蛋白、白蛋白α2-巨球蛋白、α1抗胰蛋白酶、转铁蛋白、α1抗胸腺蛋白酶、结合珠蛋白、铜蓝蛋白、纤溶酶原补体（C4）、C3活化剂、纤维蛋白原、α1酸性糖蛋白、α2-HS糖蛋白、β-脂蛋白、视黄醇结合蛋白等基因。HepG2细胞表达标志物包括胰岛素；胰岛素样生长因子II（IGF II）。HepG2细胞表现3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA还原酶和肝甘油三酯脂肪酶活性，对葛兰素酮（氧化应激）的刺激表现为apoA-I mRNA表达减少、过氧化氢酶mRNA表达增加。没有证据表明HepG2细胞中存在乙型肝炎病毒基因组。除了基于原始出版物（PubMed:6248960）的所称的肝细胞癌或肝癌细胞系外，HepG2也被称为肝母细胞瘤细胞系（PubMed:19751877）。HepG2细胞系由Wistar研究所保藏，是合适的转染宿主。

HepG2细胞培养注意事项

1、空泡现象

HepG2细胞中常有空泡，这是该细胞正常特性，不影响细胞生长，无需担心。

2、细胞生长慢

培养条件适宜的情况下，在T25培养瓶中生长的HepG2细胞，以1:2传代后，培养2-3天可以到达80%汇合率。若细胞生长过慢甚至不生长，可将血清增加至15%-20%（不要超过20%），待细胞恢复生长速度后再将血清比例降低到10%。

细胞接种密度不可过低，否则生长非常缓慢。

3、细胞聚团或不贴壁

血清品牌和培养基pH是影响HepG2细胞贴壁性的关键因素。

通常HepG2细胞呈单层生长，但遇到不合适的血清细胞可能呈现聚集倾向，最终聚团且不易消化开；也可能贴壁性变弱，漂浮细胞变多。使用高质量低内毒素未灭活的胎牛血清，可以帮助细胞更好地贴壁及形成单层细胞。

pH过高过低都将影响细胞贴壁性，每天观察培养器皿中培养基的颜色，偏黄及时换液，偏紫时检查培养箱CO2供应是否正常，培养瓶是否透气，并及时换液。

4、漂浮细胞多

排除上文中提到的血清和pH对细胞贴壁的影响，传代或复苏后若有部分细胞漂浮，是正常现象，随着培养部分漂浮细胞会逐渐贴壁。漂浮细胞较多时不要扔，使用台盼蓝检查细胞活性，若大部分是活细胞，将这些细胞离心收集后重新接种至原瓶。增加血清量（总比例不超过20%）可以促进贴壁。

消化时需注意时间不能太长，第一次消化该细胞要摸索最佳时间（操作见后文）。中和时轻柔吹打，控制吹打次数和力度，可有效减少传代后漂浮细胞。

5、有圆形细胞粘附在贴壁的单层细胞上

这在HepG2培养时是常见现象，这些细胞可能是尚未完*贴壁或者正处于分裂期的细胞，无需对此特殊处理。

HepG2细胞传代方法

1. 准备所需的培养基、胰酶、PBS、离心管、培养瓶以及无菌枪头等；（试剂提前预热）

2. 抽走培养瓶内培养基，加5mL PBS润洗1-2遍，清除残留培养基；

3. 尽量吸干润洗的PBS后加1mL胰酶，摇晃使胰酶均匀覆盖瓶底，放置培养箱37℃消化；

4. 消化时每隔1min拿出来观察，镜下可见细胞明显回缩，轻拍培养瓶部分细胞开始脱落时立即加入3-4mL含血清的培养基终止消化，吹落贴壁的细胞；

Tips：注意控制吹打力度轻柔，吹打次数不可过多，避免机械损伤

5. 将细胞悬液转移至离心管中，1000rpm，3min离心收集细胞；

6. 在新的培养瓶中加入适量新鲜培养基；（T25推荐10mL，T75推荐15mL）

7. 离心完成后，弃上清，加入适量新鲜培养基轻轻重悬吹散细胞，将细胞悬液均匀接种至培养瓶中，十字法或8字法混匀，然后放入培养箱中继续培养，注意培养瓶盖透气；

Tips：推荐传代比例1:2-1:4，首*传代建议1:2。细胞生长至80%密度时即可传代。

HepG2细胞冻存方法

1. 配制程序性冻存液，准备相应数量冻存管并做好标记。

Tips：推荐冻存液配方92%FBS+8%DMSO或92%完*培养基+8%DMSO

2. 先将细胞按传代步骤消化、离心、弃上清，获得细胞沉淀；

3. 加入适量程序性冻存液轻轻重悬细胞，并将细胞悬液转移至冻存管中；

4. 将冻存管放入程序性冻存盒，放入-80℃冰箱过夜；

5. 转移冻存细胞至液氮保存并登记细胞保存位置

Tips：

液氮保存24h后建议复苏一管检测冻存细胞的活性，若活性合格即可长期保存。

程序性冻存液需要配合程序性冻存盒使用，若使用非程序冻存液请按产品说明书处理降温过程。

T25培养瓶长满通常可冻存2-3管，10cm皿长满通常可冻存3-4管。

冻存密度低将导致复苏后细胞状态不佳。

HepG2细胞复苏方法

1. 提前将水浴锅预热至37℃，培养基复温至室温或37℃，离心机设置好转速；

2. 将细胞从液氮罐取中出，观察管内无液氮的情况下，捏住管盖，将细胞冻存部分浸入水浴锅迅速摇晃，细胞融化至米粒大小冰块时终止水浴，融化过程不超过2min；

Tips：

若液氮或冰箱距离细胞房较远，细胞需要放在干冰或冰盒上运送至细胞房。

冻存管在液氮长期保存过程中难免渗入液氮，取出细胞时震动不要过大。水浴前一定要观察管内是否存在液氮，若有液氮需静置一会待液氮完*蒸发后再水浴。做好防护，避免冻存管炸开导致受伤。

水浴时使用一次性PE手套包住冻存管避免直接接触水源，避免污染。

3. 直接将冻存管以离心力150g(约900rpm)左右离心2min，不同离心机具体转速会有差异

4. 离心完成后弃上清，用预热的培养基缓慢加入冻存管，轻柔重悬细胞后接种至培养瓶中，轻轻混匀后放入培养箱；

5. 复苏24小时后观察细胞贴壁情况。

Tips：

1. 整个细胞复苏过程在尽可能5-10min内完成。

2. 该细胞贴壁需要稳定的环境，复苏完成后请勿频繁将细胞拿出观察。

HepG2细胞收货攻略

常温细胞

1. 收货后，拆开外包装，用75%酒精消毒T25瓶表面，放37℃培养箱静置4h以上；

2.吸走大部分培养基并留10-12 mL，显微镜下拍照保存细胞状态照片，观察细胞密度，若细胞密度大于80%即可按比例传代（首*传代比例建议1：2），若细胞密度低于70%可以留10-12 mL继续培养至细胞密度80%以上再进行传代培养；

冻存细胞

1. 细胞收货后尽快开箱检查，若干冰充足可以取出细胞迅速置于-80℃冰箱（2-3天内复苏）短期保存或液氮中长期保存，若干冰完*挥发建议立即复苏细胞并联系销售人员解决；

2. 冻存细胞建议尽快复苏一管培养检查，以免超出售后期，复苏步骤参考复苏攻略；

3. 复苏一管细胞出现异常及时联系销售人员，在专业技术支持的指导下进行下一步操作；

Tips：

1. 细胞收货出现漏液、培养瓶破损、干冰完*挥发等异常情况时，及时拍照联系销售人员；

2. 尚恩生物T25瓶发货的细胞内含对应细胞的完*培养基，可以收集原装培养瓶内培养基经1500rpm离心5min后，取上清于4℃保存用于后续细胞培养；

常见问题及解决方案

细胞密度怎么计算的？

严格意义上，细胞密度需要收集细胞悬液计数细胞数量，但在实际培养过程中，并不需要为了精确控制细胞数量而消化细胞计数。因此，常用的细胞密度指细胞相对于最大生长密度的比值，贴壁细胞可以粗略的用细胞所占培养容器底面积百分比表示，即显微镜下观察培养容器底部，有细胞的区域占总区域的百分比值，当然这种表达方式受限于单个细胞生长不同密度时所占面积不同导致并不严谨，但也是相当直观、简便的表现细胞状态的一种方式。

NO.2培养过程中细胞碎片较多怎么处理？

1. 细胞内的黑色颗粒是细胞外分泌泡及细胞器折光，这个属于细胞自身特性，无法清除也无法改变，大部分细胞都会有这种现象，只是不同细胞颗粒多少有区别，细胞培养体系不适应、营养缺乏、渗透压异常等均可能导致细胞内颗粒增加，建议使用合适的培养条件。

2. 细胞外的黑色颗粒大部分是细胞碎片和细胞代谢产物，可以先吸走培养基后用PBS润洗清除，再加新的培养基继续培养。润洗不能清除的可以换液清洗后等细胞密度70-80%左右消化处理细胞，消化完成后加完*培养基终止消化，混匀细胞，收集细胞悬液900-1000rpm(约150g)离心3min，弃上清。再加5mL PBS重悬细胞，再离心后，用完*培养基重悬接种到新的培养皿。第二次PBS重悬是为了去除碎片，如果平时碎片比较少，传代时可以省略PBS重悬的步骤；如果碎片很多，建议PBS多洗几次。

NO.3细胞具体消化时间是多久？

每个实验室用的胰酶活力及消化步骤、试剂都是不一样的，不能完*规定消化时间，以实际消化效果和实验经验为准。 

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