脑静脉血管内皮细胞的的分离方法有哪些？

　　脑静脉血管内皮细胞的分离方法主要包括酶消化法和机械刮脱法，以下是具体的操作步骤：
 

　　一、酶消化法
 

　　材料准备：
 

　　无菌溶液：所有用于培养的溶液都需在37℃水浴中预热。
 

　　血管选择：通常选择新鲜的脑静脉血管，确保血管无损伤、无凝血阻塞。
 

　　血管处理：
 

　　将血管放入含有抗生素(如青霉素和链霉素)的D-Hanks液中。
 

　　在血管两端插入磨平的注射器针头并用丝线扎紧。
 

　　用注射器从一端注入D-Hanks液冲洗血管，直至流出的液体无血迹。
 

　　酶消化：
 

　　注入适量的胶原酶溶液(浓度通常为0.1%)，使血管充盈。
 

　　将血管放入37℃无菌的D-Hanks液中消化一段时间(如15分钟)。
 

　　细胞收集：
 

　　收集血管内的酶溶液，并注入含血清的培养液(如M199培养液)冲洗血管。
 

　　将收集到的液体合并于同一容器内，进行离心处理(如1000r/min离心7~10分钟)。
 

　　去除上清液，用含血清的培养液重新悬浮细胞备用。
 

　　二、机械刮脱法
 

　　血管准备：
 

　　选择适当长度的脑静脉血管。
 

　　用D-Hanks液将血管内、外冲洗干净。
 

　　刮取内皮细胞：
 

　　在无菌条件下沿血管纵轴剪开，使血管内皮朝上向外暴露。
 

　　再用D-Hanks液冲洗血管内壁。
 

　　用刮刀轻轻刮取内膜表面的内皮细胞。刮取时动作应轻柔均匀，刮刀与表面的角度适中，避免损伤血管壁。
 

　　细胞收集与处理：
 

　　将刮下的细胞悬浮于培养液中。
 

　　进行离心处理以去除杂质和上清液。
 

　　用含血清的培养液重新悬浮细胞备用。
 

　　注意事项
 

　　无菌操作：整个分离过程需在无菌条件下进行，以避免细胞污染。
 

　　酶的选择与浓度：根据血管类型和大小选择合适的酶类型和浓度。胶原酶是常用的酶之一，但不同来源和批次的胶原酶活性可能有所不同，因此在使用前需进行活性测定。
 

　　消化时间：消化时间不宜过长或过短，以免影响细胞的活性和数量。通常需根据酶的活性和血管类型进行调整。
 

　　细胞活力与纯度：分离后的细胞需进行活力检测和纯度鉴定。常用的活力检测方法包括台盼蓝染色法、MTT法等；纯度鉴定则可通过免疫荧光染色、流式细胞术等方法进行。