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人结肠癌细胞SW480冻存的方法及注意事项

发布时间:2021/4/14   点击次数:131
 
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人结肠癌细胞SW480源自原位直肠腺癌,和SW620细胞源自同一病人一年后的淋巴结转移。CSAp和直肠抗体3阴性;角蛋白免疫过氧化物酶染色阳性。p53基因第273位密码子的G→A突变引起Arg→His替代,309位密码子的C→T突变导致Pro→Ser替代。人结肠癌细胞SW480不表达细胞溶解酶,一种与肿瘤入侵相关的金属蛋白酶。
一、实验材料
①器材:液氮罐、冻存管(塑料螺口使用冻存管或安瓿瓶)、离心管、吸管、离心机、-70 ℃低温冰箱、超净工作台等。
②试剂:0.25%胰酶、培养基(DMEM+10% FBS)、冻存液(血清:DMSO=9:1)。
二、操作步骤
①37℃水浴预热培养基。
②消化细胞。
a.在超净台中,弃培养基,加人2~5 mL PBS清洗细胞后,再加入1 mL胰酶消化细胞。
b.显微镜下观察到细胞变圆,有细胞开始脱离瓶壁时,加入5 ml培养基终止消化。
c.用移液器轻轻吹下瓶壁上剩余的细胞,并轻轻吹打将细胞吹匀、打散。
③细胞计数:
a.洗净晾干血小板计数板和盖玻片,将盖玻片完全覆盖计数区。
b.充分混匀细胞,取少量(0.1~0.5 mL)细胞悬液与等体积的染色液台盼蓝混合,移液器吹吸混合均匀,用移液器取20uL混合液从盖玻片两端(与中间凹槽平行的两端)分别打入细胞,以细胞悬液刚好浸湿盖玻片为佳。
c.显微镜下,数4个计数区的总细胞数,无活性细胞染成蓝色,活细胞不被染色。
d.细胞密度=(细胞总数/4)×10000×2。
注意:这里10000是不变的,因为计数的细胞是在体积为10-4 mL计数池内,将4个计区的细胞数除以4取平均数,乘以2是补偿加等体积台盼蓝形成的稀释。
e.细胞活性=活细胞数/细胞总数×100%。
注意:当细胞密度高时,可调整细胞悬液和台盼蓝的比例,计数时乘以相应的稀释倍数即可。
f.当细胞密度达到传代密度且细胞活性在90%以上时,可以冻存细胞。
④在超净台中将要冻存的细胞移入离心管,1000 r/min离心5 min 。
⑤弃上清,加入适量配制好的冻存培养液用吸管轻轻吹打使细胞均匀,计数,调节冻存液中细胞的最终密度为5×106~1×107个/mL。
⑥将细胞悬液分装到冻存管中,每管1 mL。将冻存管口封严。如用安瓿瓶则火焰封口,封口一定要严,否则复苏时易出现爆裂。
⑦贴上标签,写明细胞种类,冻存日期。
⑧将装有细胞的冻存管放入程序降温冻存盒,4℃下存放30 min,转放-20℃冰箱4 h,然后放入-70 ℃冰箱中过夜,取出冻存管,移入液氮容器内(-196℃)。
三、注意事项
①DMSO常温下为液态,4℃冰箱放置时为固态。
②现多用塑料螺口小瓶对细胞进行冻存,使用方便而且不会炸裂,但如质量不好,有时密封不严,因而使用前要仔细检查,冻存时用胶布将瓶口缠绕包紧以防密封不严。如安瓿瓶保存细胞时,需要用火焰将安瓿瓶熔封,熔封时必须保证安瓿瓶完全封闭,同时注意不能使安瓿瓶内细胞悬液的湿度升高;冻存时,首先将安瓿瓶直立放置于塑料盆或小纸盒中,周围固定,以免倾倒,因为安瓿瓶颈部一般较薄,冻存时易被膨胀的冰挤破;安瓿瓶易炸裂,解冻时注意个人防护。
细胞冻存后,要定期检查液氮数量,如发现液氮挥发一半时要及时补充,补加液氮时要做好眼、手、脚等身体暴露部位的防护以免冻伤。细胞在液氮中储存时间理论上是无限的。但为妥善起见,特别是很多未被冻存过的细胞在*冻存后要在短期内复苏一次以观察细胞对冻存的适应性。已建系的细胞,尽量也每年取一支复苏一次后, 再继续冻存。

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