小鼠心肌细胞的分离、纯化和培养

　　小鼠心肌细胞的培养方法，可评价心肌细胞的存活状况并鉴定心肌细胞纯度。方法应用胰酶联合胶原酶共同消化3d内C57乳小鼠心脏，台盼蓝染色判断心肌细胞存活率，α－actin免疫荧光染色鉴定心肌细胞纯度。结果利用3d内乳鼠心脏可成功培养原代小鼠心肌细胞，台盼蓝染色显示细胞存活率大于95%，α－actin免疫荧光染色显示心肌细胞纯度达95%以上。结论严格控制实验条件，可成功培养高存活率和高纯度的小鼠心肌细胞。

　　小鼠心肌细胞的分离、纯化和培养：

　　心肌组织的分离：取出生0～3d的乳小鼠20只，浸泡于75%的酒精中8～10s消毒后迅速送入超净工作台，将其固定于无菌泡沫板上，用眼科剪将乳小鼠胸骨正中偏左的皮肤剪开，用镊子分离皮肤，充分暴露胸部，换另一把眼科剪做一纵向切口打开胸腔，尽量不要超出剪开的皮肤范围，忌打开腹腔，以免引起污染，根据心脏的搏动，顺势将心脏挤出。

　　取心脏放入冰冷的PBS缓冲液中吹打清洗，尽量将红细胞清洗干净，用眼科镊辅助眼科剪将多余的心房及周围肺组织等去除，随后将心脏移到另一个干净的培养皿，将心脏剪裂2～3下（裂而不断的程度即可），共清洗3遍。

　　心肌细胞的分离与培养：将心脏组织吸入玻璃培养瓶中，加入0.25%胰酶（含EDTA）10mL，静置，4°C过夜（12～16h）。第2天，取出过夜的心脏组织，加入*培养液10mL，37°C恒温水浴5min，中止胰酶的消化作用；弃去上清液，加入胶原消化液10mL（注意弃上清液时勿把心脏组织吸走）。置于37°C的恒温水浴箱，1min用手轻摇。弃上清液，将心脏组织移入另一个培养瓶中加入12mL胶原消化液，置于37°C恒温水浴箱上，用手轻摇30min，将上清液移入新的离心管中。重复消化3～4次，仅见絮状样物质即心肌组织消化*。

　　将收集的上清液离心1000r/min5min，弃上清液，加*培养液30mL，轻轻拍打管壁使得细胞悬浮于其中，随后接种在100mm培养皿中，放于37°C、5%CO2培养箱中孵育70min，差速贴壁以除去成纤维细胞和内皮细胞等非心肌细胞。轻轻吸出细胞悬液，台盼蓝染液染色计数，根据不同的实验目的用*培养基调整细胞密度，加入BrdU使其在培养液的终浓度为0.1mmol/L，轻轻混匀后，将其接种到在事先用多聚赖氨酸预包被处理过的6孔板中，37°C、5%CO2培养箱中孵育48h后，换无BrdU的*培养基，以后每隔48h换液1次。