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小鼠心肌细胞的分离、纯化和培养

发布时间:2021-10-20浏览:61次

  小鼠心肌细胞的培养方法,可评价心肌细胞的存活状况并鉴定心肌细胞纯度。方法应用胰酶联合胶原酶共同消化3d内C57乳小鼠心脏,台盼蓝染色判断心肌细胞存活率,α-actin免疫荧光染色鉴定心肌细胞纯度。结果利用3d内乳鼠心脏可成功培养原代小鼠心肌细胞,台盼蓝染色显示细胞存活率大于95%,α-actin免疫荧光染色显示心肌细胞纯度达95%以上。结论严格控制实验条件,可成功培养高存活率和高纯度的小鼠心肌细胞。
  小鼠心肌细胞的分离、纯化和培养:
  心肌组织的分离:取出生0~3d的乳小鼠20只,浸泡于75%的酒精中8~10s消毒后迅速送入超净工作台,将其固定于无菌泡沫板上,用眼科剪将乳小鼠胸骨正中偏左的皮肤剪开,用镊子分离皮肤,充分暴露胸部,换另一把眼科剪做一纵向切口打开胸腔,尽量不要超出剪开的皮肤范围,忌打开腹腔,以免引起污染,根据心脏的搏动,顺势将心脏挤出。
  取心脏放入冰冷的PBS缓冲液中吹打清洗,尽量将红细胞清洗干净,用眼科镊辅助眼科剪将多余的心房及周围肺组织等去除,随后将心脏移到另一个干净的培养皿,将心脏剪裂2~3下(裂而不断的程度即可),共清洗3遍。
  心肌细胞的分离与培养:将心脏组织吸入玻璃培养瓶中,加入0.25%胰酶(含EDTA)10mL,静置,4°C过夜(12~16h)。第2天,取出过夜的心脏组织,加入完全培养液10mL,37°C恒温水浴5min,中止胰酶的消化作用;弃去上清液,加入胶原消化液10mL(注意弃上清液时勿把心脏组织吸走)。置于37°C的恒温水浴箱,1min用手轻摇。弃上清液,将心脏组织移入另一个培养瓶中加入12mL胶原消化液,置于37°C恒温水浴箱上,用手轻摇30min,将上清液移入新的离心管中。重复消化3~4次,仅见絮状样物质即心肌组织消化彻底。
  将收集的上清液离心1000r/min5min,弃上清液,加完全培养液30mL,轻轻拍打管壁使得细胞悬浮于其中,随后接种在100mm培养皿中,放于37°C、5%CO2培养箱中孵育70min,差速贴壁以除去成纤维细胞和内皮细胞等非心肌细胞。轻轻吸出细胞悬液,台盼蓝染液染色计数,根据不同的实验目的用完全培养基调整细胞密度,加入BrdU使其在培养液的终浓度为0.1mmol/L,轻轻混匀后,将其接种到在事先用多聚赖氨酸预包被处理过的6孔板中,37°C、5%CO2培养箱中孵育48h后,换无BrdU的完全培养基,以后每隔48h换液1次。

 

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