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小鼠原代细胞的分离及细胞计数

发布时间:2021-11-15浏览:69次

  细胞培养(Ce11culture)是模拟机体内生理条件,将细胞从机体中取出,在人工条件下使其生存、生长、繁殖和传代,进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程等问题的研究。近年来,广泛地应用于分子生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学、细胞工程等领域,发展成一种重要生物技术,并取得显著成就。由体内直接取出组织或细胞进行培养叫原代培养。原代培养细胞离体时间短,性状与体内相似,适用于研究。一般说来,幼稚状态的组织和细胞,如:动物的胚胎、幼仔的脏器等更容易进行原代培养。
  小鼠原代细胞的分离及细胞计数操作:
  1、取材
  用颈椎脱位法使小鼠迅速死亡。然后,把整个动物浸入盛有75,乙醇的烧杯中数秒钟消毒,取出后放在大平皿中携入超净台。用消过毒的剪刀剪开用乙醇再次消毒后的皮肤,剖腹取出内脏器官或组织。置于无菌平皿中。
  2、切割
  用灭菌的PBS液将取出的脏器或组织清洗三次,然后用眼科手术剪刀仔细将组织反复剪碎,直到成1m左右的小块,再用PBS清洗,洗到组织块发白为止。移入无菌离心管中,静置数分钟,使组织块自然沉淀到管底,弃去上清。
  3、消化
  吸取0.25,胰蛋白酶--0.02,EDTA混合消化液1ml,加入离心管中,与组织块混匀后,加上管口塞子,37℃水浴中消化30分钟,每隔5分钟摇动一下试管,使组织与消化液充分接触,静止,吸去上清。
  4、制备单细胞悬液
  向含有经消化的器官或组织的离心管中加入2-3ml含10%小牛血清的DWEM培养基,用吸管吸打数次,直到看不到块状组织。
  5、细胞计数
  1.盖好盖玻片:取一套血球计数板,将特制的盖玻片盖在血球计数槽上。2.将细胞悬液滴入计数板:将待测细胞悬液吹均匀,然后吸取少量悬液沿盖片边缘缓缓滴入,要保证盖片下充满悬液,注意盖片下不要有气泡,也不能让悬液流入旁边槽中。3.统计四个大格的细胞数:将血球计数板放于显微镜的低倍镜下观察,并移动计数板,当看到镜中出现计数方格后,数出四角的四个大格(每个大格含有16个中格)中的细胞数目。4.计算原细胞悬液的细胞数即可。

 

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