小鼠原代细胞的分离及细胞计数

　　细胞培养（Ce11culture）是模拟机体内生理条件，将细胞从机体中取出，在人工条件下使其生存、生长、繁殖和传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程等问题的研究。近年来，广泛地应用于分子生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学、细胞工程等领域，发展成一种重要生物技术，并取得显著成就。由体内直接取出组织或细胞进行培养叫原代培养。原代培养细胞离体时间短，性状与体内相似，适用于研究。一般说来，幼稚状态的组织和细胞，如：动物的胚胎、幼仔的脏器等更容易进行原代培养。

　　小鼠原代细胞的分离及细胞计数操作：

　　1、取材

　　用颈椎脱位法使小鼠迅速死亡。然后，把整个动物浸入盛有75，乙醇的烧杯中数秒钟消毒，取出后放在大平皿中携入超净台。用消过毒的剪刀剪开用乙醇再次消毒后的皮肤，剖腹取出内脏器官或组织。置于无菌平皿中。

　　2、切割

　　用灭菌的PBS液将取出的脏器或组织清洗三次，然后用眼科手术剪刀仔细将组织反复剪碎，直到成1m左右的小块，再用PBS清洗，洗到组织块发白为止。移入无菌离心管中，静置数分钟，使组织块自然沉淀到管底，弃去上清。

　　3、消化

　　吸取0.25，胰蛋白酶--0.02，EDTA混合消化液1ml，加入离心管中，与组织块混匀后，加上管口塞子，37℃水浴中消化30分钟，每隔5分钟摇动一下试管，使组织与消化液充分接触，静止，吸去上清。

　　4、制备单细胞悬液

　　向含有经消化的器官或组织的离心管中加入2-3ml含10%小牛血清的DWEM培养基，用吸管吸打数次，直到看不到块状组织。

　　5、细胞计数

　　1.盖好盖玻片：取一套血球计数板，将特制的盖玻片盖在血球计数槽上。2.将细胞悬液滴入计数板：将待测细胞悬液吹均匀，然后吸取少量悬液沿盖片边缘缓缓滴入，要保证盖片下充满悬液，注意盖片下不要有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中。3.统计四个大格的细胞数：将血球计数板放于显微镜的低倍镜下观察，并移动计数板，当看到镜中出现计数方格后，数出四角的四个大格（每个大格含有16个中格）中的细胞数目。4.计算原细胞悬液的细胞数即可。