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非洲绿猴肾细胞进行细胞传染的步骤

更新时间:2022-01-24浏览:427次

  非洲绿猴肾细胞是从正常成年非洲绿猴的肾脏组织中分离建立的。该细胞常作为转染宿主,用于支原体的检测。细胞在培养瓶中培养至状态良好后灌满培养基运输,获得细胞后用酒精棉球擦拭瓶口消毒,然后在超净台中操作;如细胞生长至70%-80%,将瓶中的培养基移入无菌瓶中留作培养使用,保留5-8mL培养基在37℃、5%的CO2的温箱中继续培养。细胞培养至90%-100%后,按要求消化传代;弃去培养基,用无菌PBS或者其他缓冲液清洗细胞2次,加入适量胰蛋白酶消化(EDTA胰酶),待细胞*脱壁后加培养基吹打混匀,分瓶培养。
  非洲绿猴肾细胞Vero可能作为表达外源蛋白质的有用细胞。作为一种连续传代的灵长类细胞,Vero细胞的糖基化酶可能与人类的相似。Vero细胞可以大规模培养,已经用于脊髓灰质炎病毒疫苗的生产。研究了不同条件下Vero细胞的转染效率,包括脂质体和DNA的浓度,细胞数量以及细胞暴露于脂质体-DNA混合物中的时间。通过检测报告基因β-gal确定转染效率,优化不同转染参数,提高了Vero细胞脂质体转染的效率和表达水平。
  非洲绿猴肾细胞进行细胞传染的步骤:
  (1)在24孔细胞培养板中,以2.5~7.5×10°细胞/孔接种细胞于0.5ml适当*培养基中。
  (2)37℃过夜培养细胞,直到细胞生长至50~80%汇和。
  (3)在灭菌的Eppendorf管中准备下列溶液
  溶液A:用25u1无血清培养基稀释0.25~0.5ug pCDNA3LacZ。
  溶液B:用25ul无血清培养基稀释0.5~6.25ul lipofectAMINE试剂。
  (4)温和混合两溶液,室温放置15~45分钟以利于DNA-脂质体复合物的形成,与此同时,用0.5ml无血清培养基冲洗细胞一次。
  (5)混合物中加入0.2ml无血清培养基,温和混合,加入到漂洗过的细胞中。
  (6)37℃二氧化碳温箱温育2~24小时。
  (7)温育结束后,不清除转染混合物直接加入含两倍浓度血清的培养基。
  (8)转染18~24小时后,换以新鲜的*培养基。
  (9)48小时后,收获细胞或开始筛选。

 

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