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人肾小管上皮细胞HK-2的复苏操作步骤及注意事项

发布时间:2021/4/8   点击次数:150
 
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人肾小管上皮细胞HK-2属源于正常肾的近曲小管细胞,通过导入HPV-16 E6/E7基因而获得永生化。将含有HPV- 16 E6/E7基因的重组的逆转录病毒载体pL XSN 16 E6/E7转染外生包装细胞Psi-2;Psi-2细胞产生的病毒再去感染兼嗜性包装细胞系PA317,最后将PA317细胞产生的病毒颗粒导入正常的肾皮质近曲小管细胞。Southern和FISH分析显示, HK- 2细胞来源于单克隆。PCR检测证实,HK 2细胞基因组中含有E6/E7基因。

 

一.实验所需材料
①仪器:CO2培养箱、倒置显微镜超净台、离心机、37℃水浴锅。
②材料:于液氮中保存的人肾小管上皮细胞HK-2细胞冻存管、培养瓶、离心管、移液管、巴斯德吸管、废液缸、75%酒精棉球、酒精灯、记号笔、镊子、灭菌细胞培养瓶。
③试剂:完全培养基(RPM11640或DMEM)、0.25%胰蛋白酶、PBS液。
二.实验操作步骤
①调配37- 40℃的温水,或将恒温水浴箱的温度调节至37-40℃。
②操作者戴上眼镜或面罩、戴好手套,将要复苏的细胞冻存管从液氮罐中取出,迅速将细胞冻存管放人37~ 40℃水浴锅中,可用镊子夹住细胞冻存管,不断轻摇至完全融化(尽量在1min内完成)。
③将融化好的细胞冻存管放入离心机,800-1000r/min离心5 min。
④离心后,细胞下沉,在超净工作台中,倒弃上清液,用毛细管吸适量营养液加人细胞冻存管中,并轻轻吹吸数次,将下沉的细胞吹散悬浮后吸人加有适量营养液的细胞培养瓶中,置5%CO2、37℃孵箱培养。次日可以换液,弃去漂浮的死亡细胞,此时存活的细胞大部分可贴壁生长并增殖,一般一支细胞冻存管复苏后接种一瓶,培养3~5d方能长好。根据需要及细胞生长情况进行抗体活性的检测、细胞的传代、扩大培养或细胞的冻存等。
三.注意事项
①整个操作都需在无菌条件下操作,严防污染。
②将细胞冻存管从液氨罐中拿出时,要注意防止人员冻伤:如果安瓿塔封不严,在保存过程中液氨进人安瓿中,从液氮罐中取出时由于温度升高导致液氨急速气化而爆炸,使安瓿变得粉碎,飞溅的玻璃碎片可伤害手及面部等。为了防止液氮挥发引起爆炸工作人员尽量佩戴眼镜或面罩,戴手套。安瓿投人存放温水的器皿中反应后立即把盖子扣上,以防发生意外。
③在细胞复苏操作时,应注意融化冻存细胞速度要快,可不时摇动安瓿或冷冻管,使之尽快通过最易受损的温度段(-5~0℃)。这样复苏的冻存细胞存活率高,生长及形态良好。然而,由于冻存的细胞还受其他因素的影响,有时也会有部分细胞死亡。此时,可将不贴壁、飘浮在培养液上(已死亡)的细胞轻轻倒掉,再补以适量的新培养液,也会获得较为满意的结果。
④细胞复苏时应根据细胞对营养的要求选择不同的培养液,如一般细胞复苏时用DMEM培养液;杂交瘤细胞复苏时所用的营养液为含20%小牛血清的RPMI1640培养液,且在培养液中要加入一定量的饲养细胞。

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