小鼠原代细胞分离实验步骤

　　小鼠原代细胞是从小鼠的特定组织中提取出来的，则可直接得到目的基因不表达的原代细胞模型，且与我们在KO小鼠上的研究具有更好的承接性，从而让我们想要证实的实验目的更具有说服性。KO小鼠的原代细胞还可用于细胞水平的药物筛选、药物评价等方面。原代细胞（Primary cells）是指来源活体组织，经特定分离方法制备而成的初始细胞。原代细胞离体时间短且不经过永生化过程，其生物学特性未发生很大变化，仍保持原有的遗传特征，可更好地反映细胞在体内的生长状态，从而获得与体内生理功能更接近的数据。

　　小鼠原代细胞分离实验步骤：

　　1、小鼠麻醉

　　根据体重计算相应的麻醉剂量并腹腔注射（也可以用异氟烷进行空气麻醉）

　　2、对*麻醉后的小鼠进行解剖，打开腹腔，找到小鼠下腔静脉及门静脉，使用滞留针插入下腔静脉，将50-60ml的缓冲溶液一在10-20min内缓慢注射进入小鼠血液循环内，看到小鼠肝脏有明显肿胀时剪开门静脉，完成后改用缓冲溶液二进行冲洗。

　　3、冲洗完成后，将小鼠肝脏剪下，转移至DMEM高糖培养基，用DMEM培养基清洗2-3次后，使用灭菌镊子将肝脏在培养基内撕开，使原代肝细胞从肝脏内流出。

　　4、将分离得到的肝脏细胞过筛网筛选，过滤组织碎块及其他杂质，并对细胞混悬液离心，按照一定的离心力得到初步的肝细胞沉淀，此时的肝细胞中混杂着肝脏实质细胞和非实质细胞，需要使用percoll离心液进行梯度离心。

　　5、梯度离心后的细胞即为原代肝脏实质细胞，重悬后计数即可用于后续的实验，若对细胞纯度存疑，也可以进行流式测定。